多肽抗原如何制造,多肽抗原制造过程
作者:固拓多肽合成公司    发布于:2020年03月13日
摘要:多肽抗原​,多肽抗原治疗新冠肺炎,治疗新冠肺炎药物

多肽抗原,多肽抗原治疗新冠肺炎,治疗新冠肺炎药物

1、多肽合成


 

依照多肽合成常规操作合成多肽,HPLC检测纯度为95%。多肽C端增加的半胱氨酸残基用于以其巯基衔接于偶联剂上。

 

2、合成多肽与载体的偶联


 

载体蛋白选择 BSA/KLH(这里以BSA为例),用 SPDP衔接法将合成的多肽与 BSA 停止偶联:4.6mg SPDP 溶解于 740ul DMSO,终浓度为 20mM。0.1008g BSA 溶解于 2ml PBS-EDTA 溶液中,室温静置1h。运用脱盐柱洗脱多余的 SPDP。4mg 多肽参加偶联好的 BSA-SPDP 体系中室温过夜。

 

3、多抗的制备


 多肽抗原如何制造,多肽抗原制造过程

选体重 1. 5~2 kg 的安康雄性新西兰大白兔, 按常规操作卡介苗活化其免疫系统。 将偶联的 BSA多肽过滤除菌,100mg(2ml)加等体积的不完整佐剂,充沛混悬。在新西兰大白兔背部多点皮下注射,4 周后增强免疫,其后每隔 2 周停止 1 次增强免疫,注射途径与初次免疫相同,共两次后,检测效价。耳源静脉采血、别离血清。

 

4、多抗的纯化


 

Protein G 柱别离纯化 IgG 抗体:PBS pH7.4 均衡 Protein G 亲和柱,以 0.1M Gly-HCl pH3.0洗脱, PBS pH7.4透析,分装,-20℃保管。

 

抗原亲和纯化:1mM 预冷的 HCl 充沛收缩 Sepharose 4FF后,15个体积的 1mM HCl清洗去残留的蔗糖,每次清洗 2min。偶联缓冲液 0.1M NaHCO3 pH8.3 0.5M NaCl 均衡2次。多肽溶于偶联缓冲液,调理pH值到pH8.3后,参加凝胶,室温混旋 3h。参加1M预冷的乙醇胺混旋2h阻断未偶联上的活化位点。 50mM Tris-HCl pH8.0,1MNaCl 溶液与 50mM Gly-HCl pH3.5,1M NaCl 交替清洗8次。PBS缓冲液均衡10 倍体积。装柱,均衡,上样后以 0.1M Gly-HCl pH2.2 洗脱,PBS 透析,分装,-20℃冻存。

 

5、抗体效价的检测


 

抗体效价的检测有ELISA办法或免疫双扩散法,这里以免疫双扩散法为例。

 

在制备的琼脂板上按 7 孔一组的梅花形打孔(中间1孔,四周6孔)孔径约 5mm,孔距 2mm~5mm, 汲取多肽抗原悬液滴入中间孔,等倍稀释的血清分别参加外周的对称孔中。37℃温箱中作用,于 24h 后察看结果。 以呈现沉淀带的血清最高稀释倍数为该血清的琼扩效价。

 

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