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3-胰细肤水样胰蛋白酶(3C-likeProteinase,3CLPro)是新式新冠病毒的关键的胰蛋白酶,另外也是病毒感染非结构蛋白Nsp5。3CLPro能够 水解反应病毒感染活性多肽为多功能性蛋白质,针对病毒性感染与拷贝有关键功效,是开发设计抑止抗病毒的药的关键靶标。
高品质的3CLPro蛋白质是目的性药物研发和评定的重要。下列是3CLPro酶活检验方式,15min进行检验,可用以3CLPro以及缓聚剂的评定。
3CLPro
技术指标:
检验基本原理:
荧光基团EDANS和猝灭官能团DABCYL均被联接到3CLPro胰蛋白酶的纯天然底物上,当该底物未被断开时,DABCYL可猝灭EDANS莹光,进而检验不上莹光;当该底物被3CLPro胰蛋白酶断开时,EDANS莹光已不被DABCYL猝灭,随后可检验到EDANS莹光。胰蛋白酶缓聚剂的实效性也可凭着EDANS莹光抗压强度的转变开展检测。
检验方式
提前准备原材料:
Assaybuffer:50mMTris-HCl,pH7.0
2019-nCoV3C-likeProteinase(3CLPro,NovoproteinCat#CR76)
3MMDabcyl-KTSAVLQSGFRKME-Edans
检验流程:
1.配置90μl反映管理体系:50mMTris-HCl,60μMDabcyl-KTSAVLQSGFRKME-Edans,pH7.0,37℃孵育5min;
2.添加酶液10μl,搅拌,用340nm光波长激起,535nm光波长测量10min内吸光度值的转变,每一分钟载入一次标值,测算每分OD值转变值ΔODtest(以10μlAssaybuffer替代酶液设成空白试验,记为ΔODblank)。
3. 绘制标准曲线:
4. 计算3CLPro的比活(pmol/min/mg)
Vs:样品体积 (0.01ml)
Df:稀释倍数
2.204092:标准曲线斜率
C:酶浓度 (mg/ml)
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