多肽合成

水凝胶可以为间充质干细胞提供生存环境，但是它远远不能满足自然细胞外基质的需要。尤其在干细胞向软骨细胞分化的过程中，细胞的自发增殖、凝结、分化以及基质沉淀等行为在胶体中仍受到限制。

为使水凝胶基质能调节这些细胞的行为，北京大学口腔医院ShichengWei课题组将仿生多肽和KGN融合到水凝胶体系中，研究不同多肽的作用及KGN的缓释对间充质干细胞成软骨的影响。本文的题目是AchondrogenesisinductionsystembasedonafunctionalizedhyaluronicacidhydrogelsequentiallypromotinghMSCproliferation,condensation,differentiation,andmatrixdeposition,ActaBiomaterialia期刊。

在MeHA上接枝的肽对膨胀和弹性应变没有影响。较长的交联时间可以提高凝胶基体的弹性模量；较小的交联度可以增加水凝胶的孔径，而较大孔隙的水凝胶往往与促进细胞分化、增殖、聚集和基质分泌等作用密切相关。

图1：功能性水凝胶的制备和性能测定。

图2:2维和3维基质中有典型的hMSCs图像。

RGD可促进细胞的伸展和增殖，根据交联程度的不同，其形态和活性也不同。延长交联时间(90和120s)限制了细胞的扩散、迁移和增殖。RGD能指导这些细胞的行为，但是高的交联可以抑制它们。而RGD促进了整合素的高表达，且交联时间较短。调节间充质干细胞的活性与软骨缺损植入物所需的高弹性模量之间存在着一定的矛盾。

图3：封装在2D和3D基体中的hMSCs的增殖和活性。

软骨粘附(NCAM1和N-cadherin)及迁移(FAK)相关蛋白和基因数据表明，纯MeHA凝胶基质在HAV肽的作用下不能聚集MSCs，说明需要合适的水凝胶基质微环境来发挥HAV对MSCs的作用。HR组FAK、NCAM1、N-cadherin表达明显高于其它组，表现为软骨分化。提示两种肽在细胞粘附和迁移中具有协同作用，但其机制尚不清楚。

图4：培养3天后的间质凝聚分析。

图5：包被KGN的肽修饰水凝胶(HR)，包被KGN的PLGA的微球(PM)，以及包被KGN的PLGA的微球修饰水凝胶(PM-HR)。在凝胶体系中，PM-HR组的释放速率最小，KGN达到缓释；

结果表明：K@PM-HR组细胞数量、ACAN、Coll-Coll-HR组的细胞数较多；有关的基因表达和蛋白质含量表明，该水凝胶系统可持续促进HMSCs的增殖、聚集和形成成软骨细胞。

图6：在HMSC中培养14天(A-I)和28天(J-R)，观察软骨形成情况。

HR,K@HR和K@PM-HR组分泌更多的不透明基质，K@HR组和K@PM-HR组的标本更密、更亮，与软骨类似。提示KGN对软骨分化的调节和软骨基质分泌的促进作用。HR组，K@HR组和K@PM-HR组细胞分布较广，多为基质分泌。

图7：在皮下植入28、56天后，裸鼠体内含有hmsc的水凝胶植入体被移除。

K@HR组和K@PM-HR组的体重显高于空白对照组和HR组，HR,K@HR和K@PM-HR组的细胞数多于空白对照组。说明保持KGN的恒定和有效浓度，可以促进hMSCs的软骨分化，这是K@PM-HR组GAG和Coll的最高分泌量。

图8：裸鼠皮下注射水凝胶后软骨形成的实验研究。

在HAV肽调节细胞间相互作用的同时，RGD肽可增强细胞-基质相互作用，促进细胞生存和增殖。与RGD相比，HAV与RGD共同作用后，细胞聚集和软骨形成更加明显。通过3d打印凝胶支架、微流体技术和软骨组织工程等手段，该功能化持续释放的KGNHA凝胶可促进HMSCs分化，并有希望成为干细胞培养系统和临床应用的支架载体。

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