多肽合成

齐考诺肽（Ziconotide）可用于医治神经性和非神经性疼痛 。 Ziconotide通过与位于伤害体会方式初级传入神经元末端的N型钙通道 (N-typecalciumchannels)结合而起功效 ，从而减少突触传递并具备有效的抗伤害功效 。

齐考诺肽作为 一种环型 肽，且含有三对二硫键 ，其氨基酸序列为：H-Cys(1)-Lys-Gly-Lys-Gly-Ala-Lys-Cys(2)-Ser-Arg-Leu-Met -Tyr-Asp -Cys(3)-Cys(1)-Thr-Gly-Ser-Cys(2)-Arg-Ser-Gly-Lys-Cys(3)-NH2，其三对二硫键的配对已在序列中表示出。

齐考诺肽（Ziconotide）3D化学式，作为 一种含多对二硫键的环肽 ，人工合成 时使分子式中的二硫键准确产生是人造的一个难题 。 

通过巯基氧化 产生多肽分子式中的二硫键时，只含一对二硫键时很容易挑选反应标准 ，如通过气体 ，I2 ，H2O2 ，汞盐等氧化 ，可是 ，像齐考诺肽那样必须氧化产生三对二硫键的情况较为复杂，反应 会产生多种多样同分异构体 ，因而需选用适宜的氧化方式 ，即可选择性氧化 。

要实现这一点，一般是选用不一样的硫基维护基的氧化差异来做到规定 ，齐考诺肽的三对二硫键各自以气体 ，碘作为氧化物 ；通过差异氧化先产生由Trt维护的1-8，16 -20两对二流键，再通过经典氧化产生由Acm维护的15 -25 二硫键；氧化全过程由MS ，HPLC 检测 ，以后 由HPLC 纯化得到成品 。

齐考诺肽线性肽的固相生成

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环氧树脂媒介的制取

反应罐中加入 Fmoc-Linker-MB -HA -Resin环氧树脂 ，用DCM溶胀，排干，加入20 %(摩尔分数 ，相同 )吡啶 /DMF 溶液 ，震荡反应20 min ，去除Fmoc官能团 ，用DMF清洗 3遍，排干。 

加入 Fmoc-Cys(trt)-OH ，TBTU，HOBT和DIEA，N2震荡反应1h，用DMF清洗环氧树脂去除不必要的FmocCys(trt)0H制得联接环氧树脂 。

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线性肽链的生成 （经营规模 ：AA ：HB ：DIEA=1:3:3:6），去除 Fmoc维护基：向配有联接环氧树脂的反应 柱中加入 20 %吡啶 /DMF 溶液 ，震荡反应20min 。 

用DMF清洗环氧树脂3遍，产生肽键：向反应柱中加入定量分析的维护碳水化合物 (用DMF10mL融解，加入定量分析的HBIU和DIEA)，N2 震荡反应1h。排干 ，用DMF清洗3遍。

肽链增加：将前一步生成的环氧树脂肽作为下一步生成的羟基成分，反复以上接肽全过程 ，开展 25次接肽反应制得环氧树脂线性肽链 。

检验反应过程 ：用茚三酮显色剂法律性检验反应过程 ，分辨各步接肽的终点站 ，第-步去除Fmoc维护基中若环氧树脂肽呈深蓝色 ，表明Fmoc维护基已去除 。 

若在产生肽键流程中若环氧树脂肽呈深蓝色 ，表明反应不彻底 ，需再度缩合反应 ，当环氧树脂肽呈无色全透明状，表示羟醛缩合顺利完成 。

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环氧树脂线性肽链的激光切割，在烧瓶中加入干躁的环氧树脂线性肽链 ；TFA ，EDT ，对甲苯酚，苯甲乙酰氯和水（87.5:5:2.5 :2.5 :2.5 ），搅拌下于室温反应2h。 

旋蒸 ，洗剂与渗沥液合拼，用没有水医用乙醚 (5倍~10倍量 )析晶，离心分离机 ，沉积用小量没有水医用乙醚清洗 ，真空干燥机得粗肽。

4

粗品的分离纯化

HPLC 纯化标准 ：C18柱，粒度 5μm，检验波220 mm ，冲洗掉液A：0.1 %TFA 溶液 ;冲洗掉液B：0.1 %TFA 乙腈溶液 ;挑选冲洗掉梯度方向10 %~100 %，冲洗掉時间15 min，流动速度1mL /min ，粗肽经HPLC纯化制得纯的线性肽。

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二硫键的产生

（1）第一步氧化产生两对二硫键 

在烧杯中加入纯品线性肽，纯净水，用氨水调至pH8上下 ，搅拌下于室温反应 24 h。 浓缩制得粗肽，经HPLC纯化制得含2个二硫键的肽段，齐考诺肽（Ziconotide）只有两对二硫键时的3D化学式

（2）第二步氧化产生第三对二硫键 

在烧瓶中加入以上得到的肽段，25 %甲醇溶液 和碘8eq ，搅拌下于室温反应 2h，滴入硫代硫酸钠至溶液无色 ，浓缩制得粗肽，经HPLC纯化制得成品 。

写到最后：

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