多肽合成

1、多肽稳定性

关于多肽的一个常见的误解是多肽像蛋白质一样是不稳定的。事实上，多肽比蛋白质稳定得多，由于两个影响蛋白质稳定性的要素不存在多肽合成中。这两个要素是第三次折叠和蛋白酶的污染。

蛋白质很容易变性，由于它的三级构造是由非共价键联合的，例如静电互相作用和疏水互相作用。多肽的长度和蛋白质相比是很短；所以大多数肽没有足够量达到这种互相作用使之出现第三次折叠。故多肽不能像蛋白质一样变性。

多肽只能经过共价修饰或者肽键断裂被毁坏。不像蛋白质是从充溢各种蛋白酶的细胞里被纯化，合成的多肽被蛋白酶污染的几率是很小很小的。固拓生物在试验中发现在中性pH条件下，大多数生物实验的停止速度很慢。中性条件下细菌污染可能是一个严重的问题（由于多肽是细菌的一种良好的营养源）。因次，实验里用到的溶剂过滤完全比多肽的稳定更重要。

在正常条件下，多肽溶液在室温下能保管几天，在4度保管几个星期和在-20度保管若干个月或更多；冻干的多肽粉末在室温下能保管几个月，在-80度下保管几年。

准确测定多肽浓度比许多人预期的要复杂。事实上，没有一个简单的通用办法能用。

称重和紫外线吸收力是两个常用的办法。

a. 称重。 它只能提供粗略估量的多肽含量。多肽粉末是不容易处置的。要准确称量少量（<3毫克）是一个问题。另一个问题是，肽能够含有各种含量的水和即便被大范围冻干后含有的较少水平的反离子。水的的含量范围从约5％至20％，有的以至>40％。固拓生物试验中，实计含量取决于多肽序列。反离子的类型和数量取决于用于多肽纯化的溶剂和多肽序列。这些水分子产生的不肯定性是不能被疏忽。

b. 紫外线吸收性。假如您的多肽含有一个酪氨酸或色氨酸残基，多肽的定量剖析就变得愈加简单。

色氨酸在282 nm处的摩尔吸光度[1 /（M *厘米）]是5700，酪氨酸在在275 nm处的摩尔吸光度是1400。在0.1N的NaOH中，酪氨酸的-OH基团充沛去质子化。这就使酪氨酸的吸收峰为293纳米。在此条件下，它的摩尔吸光度增加到2400。值得关注的是，假如肽的侧链之间有互相作用，紫外线吸收率能够不同。

这在小的亲水性肽，这不是问题。在水溶液中，这些肽通常采用伸展构象，一切的侧链是完整暴露于溶剂中的。但关于长的疏水性多肽，固拓生物试验发现这种假定是不完整正确的。有时可察看到低水平聚合和折叠。出于这个缘由，我们以为，酪氨酸在0.1N NaOH中，在293 nm处的吸光度是最好的，由于在此条件下，肽是完整变性的。它独一的缺陷是，用于浓度测定的样品不能被恢复。

假如您的肽不含有色氨酸或酪氨酸，精确理解肽的浓度是至关重要的，独一合理的选择是氨基酸定量剖析。当然，这超出大多数实验室的日常操作。

基于上面的讨论，为了多肽的浓度的准确测定，我们激烈倡议在你的多肽的N-或C-末端添加一个酪氨酸残基。

人们经常以为用乙酰基和酰胺基分别阻断肽的两端能增加肽的稳定性，实践上这是不正确的。

大多数合成肽的序列都来源于蛋白质片段。在一个蛋白质中，多肽序列的N末端和C末端构成肽键。这不同于合成肽含有不带电荷的两端。带电荷和不带电荷的多肽的物理化学性质是完整不同的，反过来这些性质又影响多肽的功用。经过乙酰基和酰胺基分别封锁N端和C端，这些问题能够被处理，并且能够使合成肽的两端更像肽键。由于这个缘由，固拓生物用于抗体试验的多肽是末端封锁的，除非抗原位于蛋白的末端。由于相同的缘由，我们倡议顾客在停止其它功用性研讨时封锁合成肽的两端。没有理论支持有自在端的多肽是不稳定的。

当试图将多肽溶解在执行多肽生物功用的溶液中时，溶解度成为关注的焦点。一切的多肽都能溶解在有机溶剂中。但是这并没有多大的协助，由于大多数肽的研讨不能再有机溶剂中进行。

肽的溶解度最终取决于它的序列。在能够操作的条件，pH值可能是最重要的。固拓生物发现，在许多状况下，改动1-3个pH值单位能够使十分稳定的多肽完整溶解。过渡曲线通常是很峻峭的。在一个很窄的pH范围内，溶液从混浊变得明澈。这可能是由于某些残基电离状态的改动，比方His。

还有另一个缘由使pH值调整变得重要。由于用于肽纯化的HPLC溶剂含有0.1%的不能经过冻干彻底除去的TFA，收到的多肽通常含有少量的TFA。从而使得肽溶液比你预期的更具有酸性。

关于难以溶解的肽，你能够在有机溶剂中制备更高浓度的原液，例如DMS，并且在生物功用检测期间稀释肽。大多数的检测能包容1-2%的DSMO，一些以至是5%。但是这并不是总是起作用的。一些肽当从DMSO中稀释时以至在更低浓度时汇集和沉淀。

   写到最后：

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