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液相色谱是一种分离分析技术,其特点是液体作为流动相,固定相可以有多种形式,如纸张、薄板和填充床。在色谱技术的发展过程中。为了区分各种方法,根据固定相的形式,如纸色谱、薄色谱和柱液相色谱。
液相色谱仪的要求
1.流动相必须用HPLC级试剂过滤除去颗粒杂质和其他物质(用0.45μm或更薄的膜过滤)。
2.流动相过滤后应使用超声波脱气,脱气后应恢复到室温。
3.不能使用纯乙腈作为流动相,使单向阀粘住,导致泵不进液。
4.使用缓冲溶液时,样品完成后,应立即用去离子水冲洗管道和柱子一小时,然后用甲醇(或甲醇水溶液)冲洗40分钟以上,以充分冲洗离子。对于柱塞杆外部,样品完成后必须用去离子水冲洗20毫升以上。
5.如果长时间不使用仪器,应取下柱子,用堵头密封保存。注意柱子不要用纯水保存,要用有机相(如甲醇等)。),因为纯水容易发霉。
6.每次样品完成后,应用溶解样品的溶剂清洗进样器。
7.C18柱绝对不能进入蛋白质样品、血样、生物样品。
8.堵塞导致压力过大,按预柱→混合器中的过滤器→管道过滤器→单向阀检查清洗。清洗方法:
①以异丙醇为溶剂冲洗;
②在异丙醇中间用超声波清洗;
③用10%稀硝酸清洗;
9.气泡会导致压力不稳定,重现性差,因此在使用过程中尽量避免气泡。
10.如果进液管内没有液体,则使用注射器吸液:通常在输液前清洗流动相。
11.注意柱子的pH值范围,不要注射强酸强碱样品,特别是碱性样品。
12.更换流动相时,先将吸滤头部分放入烧杯中振动边洗,再插入新的。
流动相中。更换无互溶性流动相时,用异丙醇过渡。
常见故障的确定和解决方法
(1)保留时间变化。
1.柱温变化:柱温恒定,必要时需配置恒温箱。
2.等度与梯度之间未能充分平衡:流动相平衡柱至少为10倍。
3.缓冲液容量不足:使用25mmol/L的缓冲液。
4.柱污染:每日冲洗柱。
5.柱内条件变化:稳定进样条件,调节流动相。
6.柱快达寿命:采用保护柱。
(2)缩短保留时间。
1.增加流速:检查泵,重新设置流速。
2.样品超载:减少样品量。
3.键合相流失:流动相pH值保持在3~7.5检查柱的方向。
4.流动相组成变化:防止流动相蒸发或沉淀。
5.温度增加:柱恒温。
(3)延长保留时间。
1.流速下降:管道泄漏,更换泵密封圈,排除泵内气泡。
2.硅胶柱上的活性点变化:用流动相改性剂,如加三乙胺,或用碱至钝化柱。
3.键合相流失:同前(2)3。
4.流动相组成变化:同前(2)4。
5.降温:同前(2)5。
(4)肩峰或分*
1.样品体积过大:用流量配样,总样品体积小于第一峰的15%
2.样品溶剂过强:使用较弱的样品溶剂。
3.柱坍塌或形成短路通道:更换色谱柱,腐蚀性较弱。
4.柱内烧结不锈钢失效:更换烧结不锈钢,添加在线过滤器,过滤样品。
5.进样器损坏:更换进样器转子。
(五)鬼峰
1.进样阀残余峰:每次使用后用强溶剂清洗阀门,改进阀门和样品的清洗。
2.样品中未知物:处理样品。
3.柱不平衡:重新平衡柱,用流动相作样品溶剂(特别是离子对色谱)
4.三氟乙酸(TFA)氧化(肽谱):每日新配,使用抗氧化剂。
5.水污染(反相):通过变化平衡时间检查水质,使用HPLC级水。
(6)基线噪声。
1.气泡(尖峰)流动相脱气:加柱背压。
2.污染(随机噪声):清洗柱,净化样品,使用HPLC级试剂。
3.检测器灯连续噪声:更换鲈灯。
4.电干扰(意外噪声):使用稳压电源,检查干扰源(如水浴等)
5.检测器内有气泡:流动相脱气,加柱背压。
(7)峰拖尾。
1.柱超载:降低样品量,增加柱直径,采用高容量固定相。
2.峰值干扰:清洁样品,调整流动相。
3.硅羟基:
加入三乙胺,用碱性钝化柱增加缓冲液或盐浓度,降低流动相PH值,钝化样品。
4.同前(4)4同前(4)4。
5.同前(4)35.同前(4)3。
6.死体积或柱外体积过大:
尽量减少连接点,适当调整所有连接点,尽量使用细内径的连接管。
7.柱效下降:
低腐蚀条件,更换柱,使用保护柱。
(8)峰宽。
1.进样体积过大:同(4)1。
2.在进样阀中引起峰扩张L进样前后排出气泡,以减少扩散。
3.数据系统采样速度过慢:设定速率应大于每峰10点。
4.检测器时间常数过大:设定时间常数为感兴趣第一峰半宽的10%
5.流动相粘度过高:提高柱温,采用低粘度流动相。
6.检测池体积过大:用小体积池,卸下热交换器。
7.保留时间过长:等度洗脱时增加溶剂含量也可用梯度洗脱。
8.柱外体积过大:尽量减小连接管径和长度。
9.样品过载:进入小浓度小体积样品。
写到最后:
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