定制合成 Custom synthesis
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1.多肽合成的基本原理
在多肽合成化学中,多肽固相合成法可以说是一个很大的突破。它为多肽合成的自动化奠定了基础,根本原因是它不必纯化中间产物就能使合成过程能够连续进行。现阶段全自动多肽的合成,基本都是固相合成。主要过程如下:
先在Fmoc化学合成的前提下将要合成的目标多肽的C-端氨基酸的羧基以共价键形式与一个不溶性的高分子树脂相连,多肽合成的起始点就是这一氨基酸的氨基,另外它的氨基酸的羧基(已经活化)作用形成肽键,持续循环这一流程,即可获得目标多肽。
2.Antigen Grade 多肽是否要在多肽的一端增加 Cysteine?
答:不一定,偶连的方式与偶连的活化剂和氨基酸组成有关。EDC: 通过C端 COOH连接,一般要求序列中无Glu (E), Asp (D),或an amidated C-terminus;Act. EDC Method: 通过 N端的氨基偶连,要求序列中无Lys (K) 或N端没有被乙酰化;MBS:通过Cys的基团载体中其他 SH连接形成 S-S. 如果序列中无Cys,就需要添加Cys基团,最好增加在N端。
3.有哪些常用的载体用来制备多肽抗体?该如何选择?
答:需要与载体偶连以提高免疫源性,是因为多肽分子量很小,免疫应答效果差。载体大多数为高分量的蛋白质,比如KLH (铜蓝蛋白),BSA, OVA等都是常用的,首选KLH。
4.多长的多肽适合做免疫用?
答:10-15个氨基酸,虽然长一些免疫效果好一些,但是合成费用会上去。10aa以下的多肽免疫效果比较差。所以推荐10-15个氨基酸。
5.多肽状态如何?如何保存储存?
答:多肽为粉末状,一般为灰白色,多肽粉末的颜色差异与它的组成相关,一般需要避光保存。长期保存应保存在-20度,短期可以保存在4度。
6.粗品和脱盐级别的纯度和多肽的长度有关吗?
答:有关
下表列出了每步合成的产率,可以看出粗品和脱盐级别与多肽长度的相关性。
7. HPLC纯化的多肽有哪些杂质?
答:主要有短肽和微量 TFA.
8.多长的多肽为合适?
答:根据多肽合成需要多肽的长度,电荷,亲疏水性等因素。长度越长,合成粗品的纯度和产率越低,纯化的难度和无法合成的几率越高。如果多肽太短,合成的多肽在后处理过程中有一定的难度,5肽以下的多肽,如果没有有疏水的氨基酸,后处理难度会很大。15个氨基酸残基以下的多肽一般都可以得到满意的产率和得率。
9.为什么含有Cys, Met, 或 Trp的多肽难合成?
答:主要因为这些基团不稳定,易氧化。这些多肽的使用和储存都需要特别注意,避免反复开启盖子。
10.为什么有些多肽的合成产率或纯度会比较低?
答:当Val, Ile,Tyr, Phe, Trp, Leu, Gln, 和Thr这些氨基酸比邻或重复时,多肽链在合成过程中不能完全舒展溶解,导致合成效率下降。比如重复 PRO,Ser-Ser, 重复Asp, 4个连续 Gly等合成效率和产物都会导致纯度比较低。
11.含 Cys的多肽如何处理?
答:含Cys 的多肽比较容易氧化。多肽纯化过程中一般都是在pH2的酸性条件性完成的,这种条件下Cys 的SH,基本保持还原状态,不需要特殊的后处理。含 Cys的多肽会慢慢的氧化,氧化的速度取决于保存条件和序列组成。如果是需要 cys形成S-S,纯化一般需要在碱性或中性条件下纯化。
写到最后:
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