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荧光共振能量转移(Fluorescence resonance energy transfer, FRET)
莹光共振能量转移(FRET)这是一个非辐射能量越迁移的过程,供体激发态能量通过分子间电偶的相互影响转移到受体激发态。这个过程没有光子的参与,所以是非辐射的。这种分析方法具有快速、敏感和简单的优点。
FRET试验中使用的染料可以相同。但是在大多数应用中,实际上使用了不同的染料。简单来说,莹光共振能量的转移是一对偶极子从供体(染料1)转移到受体(染料2)的过程,当供体基团激起时。一般来说,供体(Donor)莹光基团的发射光谱与受体(Acceptor)基团的吸收光谱有一定的重叠。当这两个莹光基团之间的距离合适时(10–100Å)),可以观察到莹光能量从供体向受体的转移。能量转移的方法取决于受体的化学结构:
1.被转化为分子的振动,也就是说,能量转移的莹光消失了。(受体是猝光剂)
2.发射比受体本身更强的莹光特性,导致次级荧光光谱的红移。(受体是莹光发射体)。
供体基团(EDANS)和接受基因(DABCYL)与HIV蛋白酶天然底物连接均匀,当底物没有断开时,DABCYL可以淬灭EDANS,然后无法检测到莹光。在HIV-1蛋白酶断开后,EDANS不再被DABCYL淬灭,随后可以检测到EDANS莹光。通过EDANS荧光强度的变化,可以监测蛋白酶抑制剂的有效性。
FRET肽是研究肽酶非特异性的方便工具。由于其反应过程可以连续监测,为检测酶活性提供了方便的方法。供体/受体对肽键水解后产生的光泽可以衡量纳摩尔级浓度的酶活性。当FRET肽完整时,它显示了内部的闪光突然消失,但当供体/受体对面的任何肽键破裂时,它就会释放出闪光,这种闪光可以持续检测,然后可以定量分析酶的活性。
写到最后:
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