多肽合成

1. 如何维护色谱柱？

答：①建议在检测前过滤样品和流动相。

②建议每天完成样品后及时清洗。

③常规检测：测试后，将色谱柱直接反向连接，用90%的有机相冲洗45分钟，最后保存在纯甲醇或纯乙腈中。

④使用缓冲盐条件：

a.等度条件：在使用缓冲盐之前和之后，以1ml/min流速冲洗45min。

b.梯度条件：在使用缓冲盐之前，与初始流动相相同的过渡流动相以1ml/min流速冲洗45min。

注意

①过渡流相是指有机相和水相的比例与分析流相同，但不含缓冲盐。

②缓冲盐冲洗后，用90%有机相反冲洗60分钟，最后保存在纯有机溶剂中。

③使用缓冲液不能在色谱柱中过夜。

2.氨基柱在进入酸性样品时，对柱非常有害，如使用一段时间后，柱效降低，峰形变化，如何恢复？

答：5-10倍柱体积含0.5-1.0％乙腈-水(50:50)溶液冲洗柱(冲洗后当然要用无碱流动相冲洗多余氨)，然后分析这类酸性分析物时，建议在流动相中加入少许氨，如0.1％。

3.液相色谱中峰出现拖尾或双峰的原因是什么？

答：①筛板堵塞或柱失效，解决办法是反向冲洗柱子，更换筛板或柱子。

②有干扰峰，解决办法是使用较长的柱子，更换流动相或更换选择性好的柱子。

③柱子可能超载，减少进样量。

4.HPLC灵敏度不足的主要原因及解决办法是什么？

答：①样品量不足，解决办法是增加样品量。

②样品不从柱子中流出，可根据样品的化学性质改变流动相或柱子。

③样品与检测器不匹配，根据样品的化学性质调整波长或更换检测器。

④检测器衰减过多，可以调整衰减。

⑤探测器的时间常数太大，解决办法是降低时间参数。

⑥检测器池窗污染，解决办法是清洗池窗。

⑦检测池内有气泡，解决办法是排气。

⑧如果记录仪测压范围不当，可以调整电压范围。

⑨流动相流量不合适，调整流速即可。

⑩检测器和记录仪超过校正曲线，解决办法是检查记录仪和检测器，重作校正曲线。

5.做HPLC分析时，柱压不稳定，原因是什么？如何解决？

答：①泵内有空气，解决办法是清除泵内空气，对溶剂进行脱气处理。

②比例阀失效，更换比例阀即可。

③泵密封垫损坏，更换密封垫即可。

④溶剂中的气泡，解决办法是对溶剂进行脱气，必要时改变脱气方法。

⑤系统检漏，找出泄漏点，密封即可。

⑥梯度洗脱，此时压力波动正常。

6.HPLC柱验收测试时柱压过高，请问为什么？

答:柱压过高是HPLC柱用户最常遇到的问题。原因有很多，往往不是柱子本身的问题。您可以按照以下步骤检查问题的原因:

①拆下保护柱，看柱压是否还高，否则就是保护柱的问题，如果柱压还高，再检查一下。

②从仪器上取下色谱柱，看压力是否下降，否则管道堵塞，需要清洗，如果压力下降，再次检查。

③将柱子的进出口反过来连接到仪器上，用10倍柱体积的流动相冲洗柱子（此时不要连接检测器，防止固体颗粒进入流动池）。此时，如果柱压仍不下降，请再次检查。只用于使用过的柱子。

④更换柱入口筛板。如果柱压降低，则表明您的溶剂或样品中含有颗粒杂质。正是这些杂质堵塞了筛板，导致压力上升。如果柱压仍然很高，请联系制造商。一般来说，在进样器和保护柱之间连接在线过滤器可以避免柱压过高的问题。

7.为什么会出现峰宽？

答：①样品体积过大：用流量配样，总样品体积小于第一峰的15%。

②在进样阀中引起峰扩展：进样前后排出气泡以减少扩散。

③数据系统采样速度过慢：设定速率应大于每峰10点。

④流动相粘度过高：提高柱温，采用低粘度流动相。

⑤检测池体积过大：用小体积池，卸下热交换器。

⑥保留时间过长：等度洗脱时增加强溶剂含量，也可采用梯度洗脱。

⑦柱外体积过大：将连接管的直径和长度降到最低。

⑧样品过载：进入小浓度小体积样品。

8.流动相气泡的原因是什么？

答：①由于有氧气或空气的溶解，流动相溶液中经常形成气泡。

②液路阻力较大，吸液时出现真空气泡。

③当系统开始工作时，无法清除流路中的空气。

④注入样品时混入空气。

9.实验室脱气的常用方法有哪些？

答：①加热回流脱气，脱气效果最好，但不能保持。

②氦气脱气，这种方法脱气效果好，能去除90%以上的空气，但氦气价格太贵，所以用的不多。

③真空脱气，效果仅次于氦脱气，但在脱气过程中容易造成样品溶液挥发损失。

④超声波脱气，只能去除约30%的空气，但最常用于实验室。目前仍尽量使用在线脱气，方便，效果好。

10.氨基柱在进入酸性样品时，对柱非常有害，如使用一段时间后，柱效降低，峰形变化，如何恢复？

答：5-10倍柱体积含0.5-1.0％乙腈-水(50:50)溶液冲洗柱(冲洗后当然要用无碱流动相冲洗多余氨)，然后分析这类酸性分析物时，建议在流动相中加入少许氨，如0.1％。

写到最后:

杭州固拓生物科技有限公司定制多肽合成业务:药物肽、临床肽、订书肽、淀粉肽、醛肽、环肽、二硫键搭桥多肽、穿膜肽、各种抗菌肽、美容肽、磷酸化肽、PEG肽、偶联BSA和KLH抗原肽、各类酸修饰多肽、各种胺类化合物修饰多肽(苯胺、异戊胺、二乙胺)、各类荣光标记(FITC、FAM系列、DOTA、TAMRA系列、CY系列)同位素肽等。固拓生物所有产品仅限科研使用，不得用于人体，如有违反，后果自负。

原创文章如有转载，请注明出处“本文首发于固拓多肽合成生物科技有限公司(WWW.GOTOPBIO.COM)”